BINKIT^® NK细胞扩增套装（外周血单核细胞来源）

◆原理

　　BINKIT^® 可从外周血单核细胞扩增高活性的自然杀伤（NK）细胞。

◆优点・特色

●　无需饲养层细胞，即可从外周血细胞 (PBMCs)中扩增NK细胞

●　3周时间内NK细胞的数目可扩增几百到几千倍

●　NK细胞将获得增强的细胞杀伤性

●　该试剂盒适合20~50mL的外周血细胞

●　Xeno-free（不含动物来源的材料）

◆案例・应用

<试剂盒组成>

●　NK 细胞初始培养基

●　NK细胞初始培养瓶

●　NK细胞传代培养基

●　BINKIT^® 明细表(PDF格式)

<未提供材料>

●　Ficoll 淋巴细胞分层液（GE Healthcare）

●　无菌PBS

●　FBS或自体血浆（56℃加热30分钟以灭活）

<结果>

图 1 使用BINKIT^® 进行体外NK细胞扩增

利用BINKIT^® 对外周血单核细胞进行NK细胞扩增，CD3-CD56+细胞从15.8％增加到88.6％。

图 2 使用BINKIT^® 进行体外NK细胞扩增

利用BINKIT^® 对外周血单核细胞（来自健康自愿者，HD, n=3）进行NK细胞扩增。

细胞计数（左）和倍率的变化（右）表明NK细胞体在外高效扩增。

图3  使用BINKIT^® 进行体外NK细胞扩增

分别以BINKIT扩增的NK细胞（实线）和从3名志愿者新鲜分离的NK细胞（虚线）来检测NK细胞对K562细胞的杀伤性。

结果表明，扩增后的NK细胞对K562细胞杀伤性显著增强（P<0.01）。

<培养步骤>

(1) 准备试剂

在NK细胞初始培养基和NK细胞传代培养基中，加入5% (v/v) 的热灭活FBS或自体血浆。

(2) 制备外周血单核细胞（PBMCs）

通过Ficoll密度梯度离心，从人全血中分离外周血单核细胞。

(3)清洗NK细胞初始培养瓶

加入10毫升PBS至NK细胞初始培养瓶。倾斜培养瓶使PBS覆盖整个表面。

将培养瓶中液体全部倒出，小心以免刮伤培养瓶的表面。重复洗涤过程两次。

(4)从PBMCs中培养NK细胞

将1×10⁶ cells/mL 的PBMCs 悬浮于NK细胞初始培养基中。每1 mL 细胞悬浮液加入40 μL的NK细胞初始混合物。

细胞悬液转移至预洗涤的NK细胞初始培养瓶，在37℃，5％的CO₂培养3天。

(5)更换培养基及传代

同贴壁细胞处理一样，转移时置于锥形离心管，200×g离心8分钟。

去除上清，将1×10⁶ cells/mL 的NK细胞悬浮于传代培养基中，培养基内加入5mL

转移后的悬浮细胞置于常规培养瓶中，在37℃，5％ CO₂条件下培养。

每2-3天将 0.8×10⁶ cells/mL 细胞置于完全NK细胞传代培养基中，进行传代培养。

<建议培养期>

2 – 3 周

注意：试剂仅供科研使用，不可用于临床。 

<参考文献>
Xuewen Deng, Hiroshi Terunuma, Mie Nieda, Weihua Xiao, Andrew Nicol,
Synergistic cytotoxicity of ex vivo expanded natural killer cells in combination with monoclonal antibody drugs against cancer cells,
Int Immunopharmacol 14 (2012) 593-605
PMID: 23063974

Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)

长单链DNA（ssDNA）制备试剂盒

　　本产品使用Nicking切口酶法（正在申请专利的新技术），是制备高纯度且有正确序列的长单链DNA（ssDNA, 1500 base或3000 base）的试剂盒。

　　※本产品不含凝回收试剂盒。
　　※本产品用于研究，不可用于临床实验。

◆关于ssDNA的制备

　　ssDNA运用广泛，但由于制备是有PCR和使用合成DNA的寡聚体，核酸外切酶反应，逆转录酶反应等工序，无法避免内部突变和末端缺失等问题的发生。虽然纯化使用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳以及链霉亲和素包被的磁珠等方法，但还是会出现混入大量dsDNA的情况。
　　Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)，通过简单的操作，便可获得含有目的序列的高纯度长链ssDNA。

◆特点

　●　不含有变异或末端缺失，可制备1,500 base或者最长到3,000 base的长链ssDNA。

　●　全程操作与普通的dsDNA片段制备法相同，无需准备特殊的机器以及试剂。

　●　通过附加的Denaturing Gel-loading Buffer（变性凝胶上样缓冲液）进行变性，可以使用琼脂糖凝胶电泳对目的长链ssDNA进行分离纯化。

　●　凝胶电泳配有已染色的RNA作为分子量标记。

◆试剂盒的内容

◆质粒图谱

◆原理和操作方法

◆使用例

　　使用Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)制备的1,500 base和3,000 base的长链ssDNA。

　　将目的dsDNA片段(1,500 bp或者3,000 bp)在pLSODN -1或pLSODN-3的MCS（Nt.BspQI位点与Nb.BsrDI位点之间）克隆后，使用切口酶（Nt.BspQI和Nb.BsrDI）对其处理，在目的片段的两端出现切口。变性后，样品经琼脂糖凝胶电泳分离，从目的条带提取DNA，纯化。将所有的样品通过变性凝胶上样缓冲液进行变性后，再进行电泳。

　　Lane 1：已导入1,500 bp DNA片段的pLSODN-1通过切口酶处理后的样品
　　Lane 2：已纯化的长链ssDNA (1,500 base)
　　Lane 3：已导入3,000 bp DNA片段的pLSODN-1通过切口酶处理后的样品
　　Lane 4:：已纯化的长链ssDNA (3,000 base)

相关资料

说明书

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◆Funa凝胶枪和切片凝胶专用吸管

　　通过简单操作能将琼脂糖凝胶电泳后的DNA和蛋白质带部分回收的枪头以及专用短移液器。

详情请看下图：

长单链DNA（ssDNA）制备试剂盒的使用文献

　　ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes
　　Yoshimi K, Kunihiro Y, Kaneko T, Nagahora H, Voigt B, Mashimo T. Nature Communicatons.Jan;20;7:10431 (2016).

　　使用切口酶法（本产品）制备的长链ssDNA（包含了2Apeptide序列，GFP全域序列，5'端300个碱基同源臂，3'端60个碱基同源臂，全长1,194 base的互补单链DNA）以及附加了poly（A）的Cas9-poly(A)RNA，向导RNA：向大鼠受精卵显微注射Thy1-TGA，在大鼠rThy1基因C末端处高效率地将绿色荧光蛋白基因（GFP基因）全域成功敲入。本论文也是首次表明，使用长链ssDNA的lsODN法（对应ssODN的lsODN）能够提高外源基因全长的敲除效率。