–Bacstain– Bacterial Viability Detection Kit – CFDA/PI

06 細菌研究用試薬

–Bacstain– Bacterial Viability Detection Kit – CFDA/PI

• 細菌研究用試薬

CFDA/PI で菌を二重染色

• 蛍光二重染色に最適化した試薬を添加するだけのプロトコル
• 複数の指標で薬剤効果や菌の状態を評価できる
• 培養法と比較して評価にかかる時間を大幅に短縮できる

• 製品コード
  BS10　 –Bacstain– Bacterial Viability Detection Kit – CFDA/PI

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マニュアル

Q

Bacterial Viability Detection Kitで使用している染色試薬の蛍光特性を教えてください。

A

蛍光特性とその性質は以下の表をご参照ください。

なお、小社では共焦点蛍光顕微鏡と落射蛍光顕微鏡で観察した実績があります。

 

色素名	極大励起波長/極大蛍光波長	励起フィルター（推奨）	備考
CFDA	493 nm / 515 nm	B 励起	エステラーゼにより加水分解され緑色蛍光色素 (carboxy-fluorescin)を生成する。
PI	530 nm / 620 nm	G 励起	膜損傷を有する細胞内にのみ透過し、核酸を染色する。
CTC	430, 480 nm / 630 nm	Bもしくは G 励起	呼吸活性により還元され赤色蛍光色素 (CTC formazan) を生成する。
DAPI	360 nm / 460 nm	UV 励起	膜損傷の有無に関わらず細胞内に透過し、核酸を染色する。

Q

グラム陽性菌やグラム陰性菌で染色に違いはありますか？

A

各色素の特徴として、以下が挙げられます。

DAPI：	グラム陰性菌では染まりにくい場合があります。
CTC：	グラム陽性、陰性に関わらず、CTCのみでは染まりにくい傾向がありますが、-Bacstain– Bacterial Viability Detection Kit – CTC/DAPI（BS09）に付属するEnhancing Reagentを使用することで染色能が向上します。
CFDA：	一般的にグラム陰性菌では染まりにくい傾向がございますが、本製品のプロトコルに記載しています、0.1 mol/lリン酸バッファーを使用することで染色能が向上します。

Q

染色前に細菌を洗浄する必要はありますか？

A

細菌は染色前に洗浄する必要があります。
細菌を洗浄しない場合、DAPIやPIでは菌体外に存在する核酸を染色したり、CTCやCFDAでは培地成分の影響で蛍光を示すことでバックグラウンド上昇の原因となる可能性があります。
 

Q

菌の懸濁液や染色後の洗浄には何を使用すれば良いですか？

A

滅菌したPBSや生理食塩水が使用できます。

Q

蛍光が弱い場合の対処方法を教えてください。

A

試薬の添加量を増やすか（試薬濃度を上げる）、インキュベート時間を長くすることをご検討ください。

Q

CFDA/PIの二重染色後にホルムアルデヒドで固定化するのはなぜでしょうか？

A

菌の中からCFDAが漏洩することを防ぐために固定化します。

Q

取扱説明書に記載されている[0.1 mol/l-PB (pH8.5, 5%(w/v)-NaCl, 0.5 mmol/l-EDTA ]の調製方法を教えてください。

A

以下の調製例をご参考ください。

調製例）100 ml調製する場合

1. 100 ml以上の容器に、以下の試薬を計量し混合
　　・0.98g リン酸（液体）
　　・5g NaCl
　　・18.6 mg EDTA・2NA
2．超純水約70 ml程度で撹拌溶解後、1 mol/l NaOH溶液でpHを8.5に調整
3．100 mlメスフラスコに2の溶液を移し、超純水で100 mlにメスアップ

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