R-Phycoerythrin Labeling Kit – SH

08 ラベル化剤

R-Phycoerythrin Labeling Kit – SH

• ラベル化剤
• 細胞機能解析
• FCM
• 50-200㎍
• SH

抗体・タンパク質標識キット

• アミノ基でうまくいかなかった
• 蛍光色素より高感度でみたい

• 製品コード
  LK26　 R-Phycoerythrin Labeling Kit – SH

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マニュアル

Q

Labeling Kitで1次抗体を直接標識する利点を教えてください。

A

はじめて抗体標識をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
カスタマーサポートの視点から直接標識法の利点や実施例等を記載しておりますので、ご参照下さい。

下記リンクよりダウンロード可能です。

「はじめての抗体標識プロトコル　～カスタマーサポートの視点から～」

Q

サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか？

A

共存物の種類により影響することがあります。
溶液中にどのような物質が含まれるかを確認の上、状況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標識反応にご使用ください。

＜高分子：分子量1万以上＞
影響する可能性があります。
高分子でSH基をもつ化合物は、Filtration Tubeでも除くことができません。 そのため標識され、蛍光性不純物として影響します。反応に使用する前に別途除去操作を行ってください。 一方、SH基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標識・精製操作に支障がでる可能性もあります。
＊本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。

抗体の精製について、小社抗体精製キット（下記）を用いたBSAとゼラチンの除去方法をご紹介いたします。

IgG Purification Kit – A　　　IgG Purification Kit – G

 

【BSAの除去方法】

1)必要な試薬

IgG Purification Kit-A(もしくはG)(Code：AP01もしくはAP02)

市販の抗体 200µg

2)精製方法

IgG Purification Kit添付の取扱説明書に従って、精製を行う。

 

【ゼラチンの除去方法】
A, Bいずれかの方法で除去する。

A.コラーゲナーゼ（Collagenase）によるゼラチン分解

図1 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE 1: ゼラチン含有IgG溶液 2: 精製後のIgG溶液

(1) 試薬 ・コラーゲナーゼ（Sigma, #C7826） 3.5 CDU/ml 希釈溶液 ・IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02） ・市販の抗体 200 μg (2)精製方法 ・0.2% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlに酵素処理用緩衝液 (100 mmol/l HEPES, pH7.4, 0.36 mmol/l CaCl2含有) 420 μlと酵素処理用緩衝液で調製した 3.5 CDU/ml コラーゲナーゼ希釈溶液 80 μlを加えて混合する。 ・37℃、3時間インキュベートした後、IgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。 ※IgG Purification Kitでは、抗体を固定化担体に保持させる際の抗体溶液量を一回当たり200 μlとしている。しかし、上記操作でコラーゲナーゼ処理した抗体溶液量は、約1.5 mlとなるため、IgGを担体に保持させる操作を8回（200 μl×7, 100 μl×1）に分けて行う。 ※上記の方法で得られる抗体の回収率：45～50%

B. 300K 限外ろ過チューブを用いたゼラチン除去

図2 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE 1: IgG 2: ゼラチン含有IgG溶液 3: 300K限外濾過のみのIgG溶液 4: 300K限外濾過+ IgG Purification Kit – Gで精製後のIgG溶液

(1)試薬 ・300K フィルトレーションチューブ（Pall社 ナノセップ遠心ろ過デバイス（製品コード：OD300C33） ・IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02） ・市販の抗体 200 μg (2)精製方法 ・0.1% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlを300K フィルトレーションチューブ 2本に分けて限外ろ過を行う（200 μl×2, 100 μl×1, 13,500 x g）。 ・その後、回収溶液500 μlをIgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。 ※回収溶液500 μlに対し、IgG Purification KitのWashing Buffer 50 μlを添加し、精製を行う。 ゲルへの吸着操作は5回繰り返す。 ※上記の方法で得られる抗体の回収率：35～45%

 

Q

サンプルは溶液になっていても問題ないでしょうか？

A

溶液になっていること自体は問題ありません。
ただし、下記の点をご確認いただいた上でご使用ください。
-濃度-
サンプル濃度が0.5 mg/ml以下(50 μg/100 μl以下)である場合にはFiltration tubeを用いてサンプル量が50～200 μgとなるように遠心して濃縮を行ってください。
フィルター上に残ったサンプルは再溶解させる必要はありません。そのまま反応にご使用ください。

-溶液量-
Filtration tubeの容量に制限がありますので、溶液の量は100 μl以下でご使用ください。

-共存物-
・不溶性の低分子が含まれる場合は、予め遠心して上清のみを使用してください。
・分子量10,000以上の物質が含まれる場合には、別途精製を行ってからご使用ください。
　(市販の抗体の中には安定化剤としてBSAやアルブミンを含む場合があります）

Q

低分子の蛍光色素と比較して、蛍光タンパク色素を標識するメリットは何でしょうか？

A

以下のような点が挙げられます。

・1分子あたりの蛍光強度が大きいので、IgGに1分子の蛍光タンパクが標識された場合、Fluoresceinなどの数倍の蛍光強度が得られます。

・励起スペクトルの吸収域が広いので、極大を外れた波長でも励起できます。（幅広い励起フィルターが活用できます)

Q

低分子のタンパク質（分子量50,000以下）に標識する場合の方法を教えて下さい。

A

キット付属のフィルトレーションチューブは分画分子量30Kの限外濾過フィルターのため、余裕をもって50,000以上のタンパク質のご使用を推奨しております。
分子量50,000以下のタンパク質を標識される場合は、下記のような分画分子量の小さい限外濾過フィルターに変更して頂くことで、低分子のタンパク質でもラベル化可能でございます。

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PALL社　ナノセップ　 3K　製品No.OD003C33
PALL社　ナノセップ　10K　製品No.OD010C33 
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キット同梱のフィルターを用いた場合に比べ遠心に時間を要することがございますので遠心時間はご検討下さい。

Q

蛍光タンパクが3種類ありますが、それぞれの波長特性を教えてください。

A

Allophecocyanin(略：APC)　励起波長：650 nm 蛍光波長：660 nm

B-Phycoerythrin(略：B-PE) 励起波長：564 nm 蛍光波長：575 nm

R-Phycoerythrin(略：R-PE) 励起波長：564 nm 蛍光波長：575 nm

Q

標識率は出せますか？

A

標識後のサンプル溶液には、未反応のReactive体が含まれるため標識率を算出することはできません。

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