whatman 3MM滤纸的应用

whatman 3MM滤纸的应用 3030-861 3MM CHR 20X20CM 100/PK

whatman 3MM滤纸的应用—杂交筛选——cDNA序列作为探针

1．如上述将文库铺平板，噬菌斑杂交实验用E.coli宿主菌株Y1088。

2．噬菌斑于42℃生长过夜。

3．从温箱取出平板，置4℃冷却至少1h。

4．膜剥离：首先，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上给准备影印的平板编号。其次，从平板的中央开始向边缘小心将滤膜铺在菌台上。当滤膜完全变湿后（颜色变灰），再等30s。同时，用针头在平板上标出滤膜的3个不对称位置。小心将滤膜从平板上剥离，接触面向上放在一张干净的Whatman 3MM滤纸上。在进行下一步骤之前，所有的平板重复步骤4。

5．将滤膜接触面向上漂浮在变性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/LNaCl）中5min。

6．中和5min。

7．用2×SSC洗涤5min。

8．将滤膜放在一张新的Whatman3MM滤纸上，用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。

9．在真空炉中80℃烘烤2h。

10．用6×SSC预先短暂地湿润滤膜，然后用预洗液（50 mmol/LTris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1%SDS）于68℃预洗涤至少1h。用一个盘子放在水浴摇床上。

11．将25张滤膜转移到一个装有50ml杂交液（5×SSPE；1×Denhardt’s液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的贮存罐内（直径至少90mm），68℃预杂交2h。

12．对于每ml杂交液，2倍的105至1×106cpm的双链探针经沸水浴变性10min后，迅速放冰上冷却。

13．变性探针立即加到预杂交混合液中。

14．在封口的贮存罐内于68℃杂交过夜，不断地晃动以防滤膜粘在一起。

15．杂交结束后，滤膜用2×SSC，0.01％SDS于室温洗涤3次约1h。

16．将潮湿（防止干燥）的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或X光片上，用放射性墨水在针头标签上作标记。

17．滤膜用塑料包装袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光过夜。