Megazyme 总淀粉检测试剂盒K-TSTA说明书
简介:
酸水解法和酶法被广泛的应用于淀粉含量测定,酸水解法仅仅适用于纯净的淀粉样品,应用范围有限。酶法的前处理步骤上有各种变化，经过凝胶、液化和糊精化作用,糊精水解生成葡萄糖,最终以测量的葡萄糖计算淀粉含量。AACC方法76-11特殊之处在于：在高压蒸汽和碱性环境下淀粉糊化成为凝胶，然后再用淀粉葡糖苷酶将淀粉转化为葡萄糖进行测量。AACC方法76-11会低估某些样品的淀粉含量，包括高多糖玉米淀粉和众多的经过加工的谷物产品。今天应用的众多的测定方法都使用了联合处理方法,如在样品处理过程中或直接在淀粉凝胶化后使用耐热α-淀粉酶。对于难凝胶的样品(如高多糖玉米淀粉)使用了氢氧化钠或二甲基亚砜作为溶剂。为确保膳食纤维中的淀粉能够全部溶解，Englyst和Cummings(1988)总结的处理方法中使用了去分支酶,支链淀粉酶。
为了测量极端样品得到满意结果，兼顾数量和可靠性，Megazyme提供了一个总淀粉分析试剂盒，基于使用耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。这一方法已被AOAC和AACC采用 (Method 76.13)。
最近，耐热淀粉酶可在低pH环境下使用。因此，我们更新了我们的总淀粉测量方法加入了这种酶。这一改进的最大益处在于可以在同一pH（pH5.0）条件下进行耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶孵育，简化步骤以及减少麦芽酮糖（抗耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解）的产生。另一改进是使用己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/ NADP+在D-葡萄糖处理步骤(K-TSHK5)。Megazyme总淀粉分析方法可以测量广泛范围内食品，饲料，植物和谷类产品（自然的或加工的）。对于大多数样品（例如小麦面粉），淀粉可以在100°C抗耐热性淀粉酶处理步骤中完全可溶。包含高水平抗性淀粉（例如高多糖含量玉米淀粉）样品，需要先用冷2 M KOH 或 热DMSO进行预溶解。含可溶性淀粉和糊精的样品，无需进行抗耐热性淀粉酶处理。
原理:
抗耐热性淀粉酶水解淀粉为可溶性分支麦芽糊精和去分支麦芽糊精。
样品中的抗性淀粉可用2M KOH进行预溶解，再用醋酸钠缓冲液进行中和再进行淀粉酶水解。或者用DMSO在100°C进行溶解。
淀粉葡萄糖苷酶水解麦芽糊精至D-葡萄糖。
D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸脂，释放出(H2O2)，再用过氧化氢酶催化进行显色反应，产生醌亚胺染料。
样品包含高水平的D-葡萄糖和麦芽糊精可以在分析前用80%乙醇进行洗涤。单个样品可在70分钟内完成测定。20个样品可在2小时内完成。
特异性，灵敏度，线性范围和精确性
此试剂盒专用于分析a-葡聚糖（包括淀粉，糖原，植物糖原和非抗性麦芽糊精）。
最小可区分的吸收值是0.01吸收值范围。这对应于1.0mg的D-葡萄糖（或0.9mg淀粉）/L在最大样品体积1ml。检测极限：2.0mgD-葡萄糖（或1.8mg淀粉）/L，这对应于0.02吸光度区别在最大体积1ml中。
此试剂盒在5-100ugD-葡萄糖范围内呈线性。一个样品溶液的重复测定中，吸收值会有0.005至0.010的波动。当样品体积为1ml时，这相当于0.05-1ml/L浓度的D-葡萄糖。如果样品在准备过程中被稀释，结果需要乘以稀释倍数。例如在样品准备时，样品称重，如10g/L，变异范围将在0.02至0.05g/100g。
干扰:
如果D-葡萄糖的转化在5分钟内完成，不会产生干扰。可以通过加入D-葡萄糖至反应完成后试管内（例如50ug在0.1ml）以检测干扰。可以看到吸光度显著上升。
样品内的干扰物质可以通过加入内标进行分析。可以对这标准进行定量校正。样品操作中的损失可以通过在起始步骤中加入D-葡萄糖进行校正。
试剂盒成分
Megazyme总淀粉含量测定试剂盒提供有足够运行100次试验的试剂,并提供有全部的试验方法:
瓶1: 耐热α-淀粉酶(10mL, 3,000U/mL在CERALPHA试剂中pH6.5; 40°C 或1600U/mL在CERALPHA试剂中pH5.0; 40°C)。稳定性>4年, 4°C保存。
瓶2: 淀粉葡糖苷酶(10mL, 3300U/mL在可溶性淀粉)（或200U/mL在p-nitrophenylβ-maltoside*，pH4.5，40°C）稳定性>4年, 4°C保存。
完整的分析程序可在www.megazyme.com获得。
瓶3: GOPOD试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液（0.26M，pH7.4），对羟基苯甲酸（0.22M），叠氮化钠（0.4%W/V）稳定性>4年, 4°C保存。
注意：
- 如果GOPOD缓冲液存储在-20°C，会形成盐结晶，用双蒸水稀释至1L前必须完成溶解。
- 此溶液含叠氮化钠（0.4%W/V），有毒。
瓶4: GOPOD试剂酶。葡萄糖氧化酶(> 12,000 U) 和过氧化物酶(> 650 U)和4-氨基安替比林（80mg）。冻干粉，稳定性>4年, -20°C保存。
瓶5: 葡萄糖标准溶液（5ml，1mg/mL）在0.2% W/V苯甲酸溶液中。稳定性>4年，室温保存。
瓶6: 标准的玉米淀粉。淀粉含量见标签。稳定性>4年, -20°C保存。
准备试剂溶液
溶液1 用试剂1（100mM醋酸钠缓冲液, pH5.0，自备）稀释1.0mL瓶1成分至30mL 。分成小份后冻存。稳定性>3年, -20°C保存。
注意：如果按照AOAC方法996.11（example b），用试剂4（50mM MOPS缓冲液,pH7.0）稀释酶。
溶液2 此酶不用稀释可以直接使用,由于酶溶液具有一定粘稠度,所以必须使用正确的移液器。4°C下保存,稳定性>3年。
溶液3 用蒸馏水稀释瓶3成分（GOPOD试剂缓冲液）到1L, 立即使用。
溶液4 用20ml溶液3溶解瓶4成分再倒回溶液3瓶子。铝箔纸包裹避光。这就是 葡萄糖测定试剂(GOPOD试剂) 稳定性: 4°C下保存，3个月；-20°C下保存， 12个月；
分装成小份再进行冻存，只能冻融一次。
新鲜配制的试剂呈浅黄色或浅紫色。4°C下保存2-3个月过程中，逐渐变成深紫色。用水为空白对照时，此溶液的吸光度<0.05。
溶液5&6 同瓶5&6
自备试剂
1.醋酸钠缓冲液(100mM, pH5.0) +氯化钙(5mM)
5.8ml冰醋酸(1.05g/mL)加入900mL蒸馏水,用1M(4g/100mL)NaOH调节pH到5.0,大约需要30mL。4°C下保存2个月.
添加0.74g二水氯化钙完全溶解, 定容到1L, 4°C下保存>6个月。
注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。室温2年。必须在pH调完后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。
2.醋酸钠缓冲液(1.2M, pH3.8)
69.6ml冰醋酸(1.05g/mL)加入800mL蒸馏水, 用4M NaOH调节pH到3.8, 定容到1L。室温下保存12个月。
3.氢氧化钾溶液（2M）
加入112.2 g KOH 至900 mL 去离子水，搅拌溶解，定容一升。储存于密闭容器。室温下>2年。
- MOPS缓冲液(50mM,pH7.0)+氯化钙(5mM) +叠氮化钠(0.02%)（仅用于example b分析样品）
11.55g MOPS(钠盐, Sigma cat. M-9381)加入900mL蒸馏水, 用1M(10%V/V)HCl调节pH到7.0,大约需要17mL。 添加二水氯化钙(0.74g)和叠氮化钠(0.2g), 完全溶解, 然后调整到1L, 4°C下保存6个月。
- 醋酸钠缓冲液(200mM,pH4.5)+叠氮化钠(0.02%)（仅用于example b分析样品）
冰醋酸(11.8mL,1.05g/mL)加入900mL蒸馏水, 用1M(4g/100mL)NaOH调节pH到4.5,大约需要60mL。加入叠氮化钠(0.2g),完全溶解,然后调整到1L, 4°C下保存6个月。
注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。室温2年。必须在pH调完后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。
设备:
1.玻璃试管(圆底;16x120mm或18x150mm)
2.离心机(3,000rpm)
3.微量移液器(100uL).
4.连续分配器
5.分析天平.
6.分光光度计510nm.
7.漩涡混合器
8.定时钟
9.沸水浴锅和试管夹
注意事项:
1.GOPOD试剂的孵育时间没有严格规定,但是至少要20分钟,并在60分钟内测定吸光度.
2.每次试验必须设定试剂空白对照和葡萄糖对照(100μg, 四倍)。
a)试剂空白对照: 0.1mL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液
b)葡萄糖对照包括:0.1mL葡萄糖标准溶液(100μg/0.1mL)+3.0mLGOPOD溶液。因子F（页码13和14）通过D-葡萄糖在标准分析中读得的吸光度进行计算（例如100/1.038=96.386）。
3.每次试验必须设定标准面粉或淀粉样品
4.每一新批此的GOPOD溶液,必须验证其与100μg葡萄糖标准反应产生颜色所需要的最长时间, 通常为15分钟左右。
样品空白:
样品空白按照标准试验程序（example A）进行,将第4步修正为添加3mL蒸馏水,第5步中也用蒸馏水替代其中的淀粉葡糖苷酶.也可以用样品前处理中所用的酒精作为样品空白( example E)。
样品准备示例
A.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（建议的程序，pH5.0孵育）。
1.研磨谷物, 过0.5mm筛（35目）。
2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。
3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v)湿润样品帮助分散, 用漩涡混合器混合。
4.立即加入3mL耐热α-淀粉酶(100mM醋酸钠稀释), 在沸水浴中孵育6分钟(在孵育2分钟,4分钟，6分钟的时强烈振荡试管).
注意:在这一步中强力震荡是关键，目的是确保浆状样品能完全的混匀（去除块状）。同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙烯管，增加孵育时间至12分钟，在 4, 8和12强烈震荡。
5.将试管放置于50°C的水浴锅中, 加入0.1mL瓶2成分（淀粉葡糖苷酶,330U在淀粉上）。充分混合,在50°C下孵育30分钟。
6.将全部的溶液转移到100mL的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积, 充分混匀。取部分溶液离心(3,000rpm,10分钟)。取清澈的未稀释的上清用于分析。
注意：对于含有1-10%淀粉的样品,在第6步中用蒸馏水调整溶液至10mL,充分混匀,离心(3,000rpm,10分钟),该溶液可以直接进行第7步.对于含10-100%淀粉的样品,用蒸馏水稀释1.0mL样品液到10mL再进行第7步。
7.转移两份稀释的样品溶液(0.1mL)到园底试管中(16x100mm)。
8.加入3.0mLGOPOD溶液到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白对照), 然后在50°C下孵育20分钟
9.葡萄糖对照包括0.1mL葡萄糖标准溶液(1mg/mL)+3.0mLGOPOD溶液。 试剂空白对照: 0.1mL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液
10.相对于试剂空白在510nm下测定每一个样品和葡萄糖质控的吸光度。
B.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（AOAC 996.11）。
1.研磨谷物, 过0.5mm筛（35目）。
2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。
3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。
4.立即加入3mL耐热α-淀粉酶(50mM MOPS稀释), 在沸水浴中孵育6分钟(在孵育2分钟,4分钟，6分钟的时强烈振荡试管).
注意:在这一步中强力震荡是关键，目的是确保浆状样品能完全的混匀（去除块状）。同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙烯管，增加孵育时间至12分钟，在 4, 8和12强烈震荡。
5.将试管放置于50°C的水浴锅中, 加入醋酸钠缓冲液（4ml，200mM，pH4.5），加入0.1mL瓶2成分（淀粉葡糖苷酶, 20U）。充分混合,在50°C下孵育30分钟。
- 按照example A 步骤6继续实验。
C.含抗性淀粉，不含D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（建议KOH溶解）
1.研磨谷物, 过0.5mm筛（35目）。
2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。
3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。
4.放入搅拌架子，加入2ml 2M KOH至每个试管中，冰水混合浴中搅拌20分钟左右，重悬粉末和溶解抗性淀粉。
注意：
1.不要使用涡旋仪混匀，会使淀粉乳化。
2.确保加入KOH时，试管处于剧烈震荡状态。这是为了避免淀粉形成团块难以溶解。
5.当试管在磁力搅拌器上搅拌时，加入8ml 1.2M醋酸钠缓冲液（pH3.8）至每个试管。立即加入0.1ml耐热α-淀粉酶（瓶1）和0.1mL淀粉葡糖苷酶（瓶2），充分混合,在50°C下孵育
- 孵育30分钟，间断混匀。
- 样品淀粉含量>10%：将全部的溶液转移到100mL的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积至100ml, 充分混匀。取部分溶液离心(1800g,10分钟)。
- 样品淀粉含量<10%：直接离心(1800g,10分钟)。总体积约10.4ml（此体积可能有一定波动，特别是湿样品用于分析时，估计体积用于计算）。
- 按照example A 步骤7继续实验。
D.含抗性淀粉，不含D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（AOAC 996.11 DMSO溶解）
1.研磨谷物, 过0.5mm筛（35目）。
2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。
3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。
4.立即加入2ml DMSO，涡旋混匀。沸水浴5分钟。
5.按照example A 步骤4继续实验。
E.含D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物
1.研磨谷物, 过0.5mm筛（35目）。
2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。
3.加入5mL乙醇溶液(80%v/v)，80-85°C孵育5分钟。涡旋混匀，再加入5ml乙醇溶液(80%v/v)。
4.离心1800g（3000rpm）10分钟。去除上清。
5.10mL乙醇溶液(80%v/v)重悬沉淀。离心去除上清。
- 按照example A 步骤4继续实验。
若样品含抗性淀粉，按照example C步骤4继续实验。
计算:
ΔA=相对于试剂空白所读取的吸光度
FV=总体积（例如100ml或10ml）
0.1 =样品分析体积
1/1000=转化从ug至mg
100/w=淀粉作为干粉重量的比例。
W=干粉重量
162/180=D葡萄糖转化为脱氢葡萄糖
淀粉%(占干物质比重):＝淀粉%X100/100-水分含量(%)