Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)

长单链DNA（ssDNA）制备试剂盒

　　本产品使用Nicking切口酶法（正在申请专利的新技术），是制备高纯度且有正确序列的长单链DNA（ssDNA, 1500 base或3000 base）的试剂盒。

　　※本产品不含凝回收试剂盒。
　　※本产品用于研究，不可用于临床实验。

◆关于ssDNA的制备

　　ssDNA运用广泛，但由于制备是有PCR和使用合成DNA的寡聚体，核酸外切酶反应，逆转录酶反应等工序，无法避免内部突变和末端缺失等问题的发生。虽然纯化使用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳以及链霉亲和素包被的磁珠等方法，但还是会出现混入大量dsDNA的情况。
　　Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)，通过简单的操作，便可获得含有目的序列的高纯度长链ssDNA。

◆特点

　●　不含有变异或末端缺失，可制备1,500 base或者最长到3,000 base的长链ssDNA。

　●　全程操作与普通的dsDNA片段制备法相同，无需准备特殊的机器以及试剂。

　●　通过附加的Denaturing Gel-loading Buffer（变性凝胶上样缓冲液）进行变性，可以使用琼脂糖凝胶电泳对目的长链ssDNA进行分离纯化。

　●　凝胶电泳配有已染色的RNA作为分子量标记。

◆试剂盒的内容

●	Plasmid
●	Denaturing gel-loading buffer
●	Prestain marker for RNA highDynaMarker®

◆质粒图谱

◆原理和操作方法

1.	对附加了目的DNA片段的质粒的MCS（多克隆位点）中两个切口酶位点之间或者是切口酶位点与限制酶位点之间进行克隆。
2.	对克隆位点使用相应的切口酶和限制性内切酶消化质粒。
3.	消化后的质粒通过附加的Denaturing Gel-loading Buffer（变性凝胶上样缓冲液）进行变性，进行琼脂糖凝胶电泳。
4.	切出跑在前端的带，纯化后得到目的ssDNA。

◆使用例

　　使用Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)制备的1,500 base和3,000 base的长链ssDNA。

　　将目的dsDNA片段(1,500 bp或者3,000 bp)在pLSODN -1或pLSODN-3的MCS（Nt.BspQI位点与Nb.BsrDI位点之间）克隆后，使用切口酶（Nt.BspQI和Nb.BsrDI）对其处理，在目的片段的两端出现切口。变性后，样品经琼脂糖凝胶电泳分离，从目的条带提取DNA，纯化。将所有的样品通过变性凝胶上样缓冲液进行变性后，再进行电泳。

　　Lane 1：已导入1,500 bp DNA片段的pLSODN-1通过切口酶处理后的样品
　　Lane 2：已纯化的长链ssDNA (1,500 base)
　　Lane 3：已导入3,000 bp DNA片段的pLSODN-1通过切口酶处理后的样品
　　Lane 4:：已纯化的长链ssDNA (3,000 base)

相关资料

 

说明书

相关产品

 

生产商	产品编号	商品名	规格
BDL	DM260	DynaMarker, Prestain Marker for   RNA High	180μl
BDL	DM122	DynaMarker, DNA High D	1set

 

◆Funa凝胶枪和切片凝胶专用吸管

　　通过简单操作能将琼脂糖凝胶电泳后的DNA和蛋白质带部分回收的枪头以及专用短移液器。

详情请看下图：

长单链DNA（ssDNA）制备试剂盒的使用文献

　　ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes
　　Yoshimi K, Kunihiro Y, Kaneko T, Nagahora H, Voigt B, Mashimo T. Nature Communicatons.Jan;20;7:10431 (2016).

　　使用切口酶法（本产品）制备的长链ssDNA（包含了2Apeptide序列，GFP全域序列，5'端300个碱基同源臂，3'端60个碱基同源臂，全长1,194 base的互补单链DNA）以及附加了poly（A）的Cas9-poly(A)RNA，向导RNA：向大鼠受精卵显微注射Thy1-TGA，在大鼠rThy1基因C末端处高效率地将绿色荧光蛋白基因（GFP基因）全域成功敲入。本论文也是首次表明，使用长链ssDNA的lsODN法（对应ssODN的lsODN）能够提高外源基因全长的敲除效率。