DsDD cDNA Subtraction Kit (和光新推)

双链特异性直接消化cDNA削减试剂盒

　　无需断片即可削减Tester cDNA。

　　DsDD(Duplex-specific Direct Digestion) cDNA Subtraction Kit Wako是从cDNA库通过削减法配制Tester和Driver cDNA。利用Tester和cDNA混合形成组织非特异性表达的基因，再通过双链特异性DNA核酸酶-Duplex-specific nuclease分解杂交cDNA。分解后，用ExonucleaseⅠ分解去除残留Driver cDNA，从而实现在Tester cDNA中高效浓缩特异性表达的cDNA。

　　本品用作解析癌细胞组织特异性功能和性质时，Tester cDNA从癌细胞组织、而Driver cDNA从正常细胞中提取，可浓缩来自癌细胞组织特异性表达的基因的cDNA 。DsDD cDNA Subtraction Kit 中的cDNA库 可作为起始材料，全部工序完成仅需2天，是划时代的技术。

◆特点

●　可从cDNA库制作

●　Tester和Driver的优异选择性

●　采用Duplex-specific nuclease去除法

●　操作简单，作业工序仅需2天

◆试剂盒原理

准备Tester cDNA库和Driver cDNA库。在Tester cDNA库中，cDNA插入方向要与载体一致。 １．扩增Tester cDNA 扩增DNA中在5’端添加磷酸引物使用。 ２． λ 核酸外切酶处理 识别双链DNA 5’端磷酸化引物并从5’到3’开始降解。Tester没有杂交，削减效率加强。 ３．限制性内切酶处理 消化两端的接头保证准确的杂交结果。 ４．杂交 Tester cDNA和Driver cDNA在68℃中反应16-20小时（混合比率=1:200）。过量的Driver cDNA使大部分Tester cDNA形成单链DNA。 ５．双链特异性核酸酶处理 酶特异性酶切单链DNA。高反应温度（68℃）保证反应的特异性。 ６．核酸外切酶 I处理 酶特异性酶切单链DNA。非特异性基因为单链，然后被降解。反应后，Tester能特异性表达基因的单链DNA能保留。 此高效cDNA削减方法完成仅需2天。

◆使用案例

　　利用人肝癌来源的HepG2细胞和人正常肝脏来源的cDNA库，对高表达管家基因-GAPDH和HepG2细胞中特异性表达的AFP基因进行削减。

 

　　在HepG2 cDNA和正常肝脏cDNA都能检测出GAPDH的条带，但Subtraction cDNA没有检测出条带。另外，正常肝脏组织cDNA没有检测出AFP条带，但在Subtraction cDNA中能检测到与HepF2 cDNA同等亮度的AFP条带。通过本方法得到的Subtraction cDNA能高效浓缩HepG2的特异性表达基因。

Q&A

Ｑ： 　DsDD cDNA Subtraction Kit做什么的试剂盒？

Ａ：　将需要做比较的cDNA库用PCR进行扩增制备Tester和Driver cDNA，对DNA扩增产物进行削减的试剂盒。与传统方法相比，操作更简便，实验时间也仅需2天时间。可以将现有的cDNA库或市面售卖的cDNA库直接开始进行实验，这是传统方法所不能做到的。而且最终制备出来的Subtraction cDNA是混入管家基因较少的cDNA，可以直接应用于各种用途。

Ｑ： 　DsDD cDNA Subtraction Kit有什么优点？

Ａ：●　直接使用现有的cDNA，全部工序完成仅需2天。

Ａ：●　全程在DNA状态下进行，无需熟练的操作技术。cDNA的制备有非常高的选择性。

Ａ：●　可以通过市面或用户自己准备的质粒cDNA来制备。

Ａ：●　除了质粒以外，还可以从5’和3’端带接头的cDNA制备cDNA。

Ａ：●　操作简便

Ａ：●　最终制备出来的Subtraction cDNA反映最初所用的Tester cDNA。因为Tester没有经过限制性内切酶处理，所以一开始的Tester cDNA可以反映最终制备的Subtraction cDNA的状态。原理上，在载体库使用全长cDNA，就能反映Subtraction cDNA的全长。

Ａ：●　只要改变Tester和Driver，就能进行反向削减。

Ａ：●　制备的Subtraction cDNA可以立刻应用于各种用途。

Ａ：●　制备的Subtraction cDNA中，混入管家基因的量少，所以它还可以作为载体亚克隆（系统序列）和DNA芯Ａ：　片的探针使用。

Ｑ： 　与PCR-Select法有什么不同？

Ａ：　

	起始材料	接头添加	杂交次数	house-keeping基因污染
DsDD法	cDNA库或5’和3’末端带接头的cDNA	不必要	1次	已经分解去除， 污染小
PCR-Select法	RNA	必要	2次	未经分解去除， 有污染的可能性

●　PCR-Select法每次都需要通过RNA制备cDNA，DsDD法则只需cDNA库就能进行实验。另外，采用PCR-Select法必须用Rsal（4碱基内切酶）酶切，将低分子化的接头分子与3’或5’端结合。而DsDD不需要。因此最终的Subtraction cDNA能反映最初的Tester cDNA的状态。

●　PCR-Select法需要进行两次杂交，而DsDD法只需一次。

●　PCR-Select法需要从大量cDNA样品中用Supression-PCR对SubtactedcDNA进行特异性扩增，而DsDD法则是通过对与管家基因等共同表达的基因进行杂交后，用分解去除的方式，极力减少管家基因的污染。DsDD法的原理上是形成Subtraction cDNA群，因此可以直接应用于克隆和DNA芯片的制作。

Ｑ： 　操作DsDD法时，特别需要注意的事项是什么？

Ａ：1.     使用Tester，运用单向插入的cDNA库。

Tester的cDNA库，必须对载体使用单向插入的cDNA库。若不用单向cDNA库，即使是用λ核酸外切酶处理成单链，有意链和反意链的cDNA会混为一体，Tester聚集杂交，是降低Subtraction效率的主要原因。

Ａ：2.     使用去除低分子DNA的色谱柱

DSN(Duplex-specific nuclease)是8bp以上的完全一致的双链DNA分解酶，因此其短断片残留多。在乙醇沉淀中，无法去除这些断片或引物。引物残留的非特异性杂交，是DSN的非特异性分解的原因。DSN的分解产物在最后的PCR时，变成非特异性引物，是形成低分子断片等非特异性断片增加的原因。

Ａ：3.     用乙醇共沉淀时，务必使用配套的Ethachinmate（乙醇沉淀核酸载体）

共沉淀时使用tRNA等核酸，会与Tester cDNA发生非特异性杂交。引起DSN的非特异性分解。

而Ethachinmate（乙醇沉淀核酸载体）是聚丙烯酰胺类的共沉淀剂，DNA回收率高达100%。即使通常不可见的沉淀也可以变为可见，在操作移液器时避免误吸。

Ａ：4.     使用适用于1μl的移液器。

Ａ：1μl的移液操作时，尽可能使用合适的吸移管操作（如Gilson公司的PIPETMAN 2P）。特别是在进行杂交时，Tester ssDNA和Driver dsDNA需要注意移液操作。这一操作中，Tester：Driver=1:200这一比率的把握尤为重要，尽可能减小在移液移过程中的误差。

Ａ：5.     酶反应时使用PCR管。
说明书记载DNA扩增反应应尽可能使用PCR管。PCR热效率较好可以进行正确的反应。

Ｑ： 　除试剂盒外还需准备什么？

Ａ：1.     Tester和Driver扩增用的cDNA库

Ａ：2.     Tester和Driver扩增用的Primer

Ａ：3.     参照基因扩增用Primer（GAPDH、β-Actin等）

Ａ：4.     DNA聚合酶（TOPOTAQ DNA polymerase等）

Ａ：5.     ｄNTP Mixture

Ａ：6.     低分子DNA和Primer去除用色谱柱

Ａ：7.     限定性酶

Ａ：8.     苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)

Ａ：9.     70％、99.5％乙醇

Ａ：10.   DNA分子量marker

Ａ：11.   琼脂糖

Ａ：12.   溴化乙锭

Ａ：13.   1×TAE　Buffer

Ａ：14.   Loading Buffer

Ａ：15.   灭菌蒸馏水

Ｑ： 　DsDD是什么的缩写？

Ａ：　DsDD是Duplex-specific Direct Digestion(双链特异性直接消化)的缩写。通过Duplex-specific DNA Nucelase，可以特异性切断杂交形成的DNA群。

Ｑ： 　Tester和Driver是什么？

Ａ：　特异性表达的cDNA端叫“Tester”，作为基准的cDNA一般称为“Driver”。从癌特异性cDNA库制备的cDNA为“Tester”，正常细胞来源的cDNA库配制的cDNA则为“Driver”。

Ｑ： 　应选用何种凝胶过滤柱？

Ａ：　可以使用能去除100bp以下的，市面售卖的凝胶过滤柱。Code No.：195-14451 Spin Cleaner

Ｑ： 　杂交一定要经过16小时么？

Ａ：　16~20小时都是没有问题的。建议16个小时是因为考虑到从实验当天17点开始进行杂交的话，第二天上午9点就可以进行下一项操作。

Ｑ： 　按照protocol制备Driver ds cDNA，但还是不能配出200ng/μl的浓度，应该如何解决？

Ａ：　浓度比较小的时候，请用乙醇共沉淀法操作。离心管中加入Tester 1ng、Driver 200ng后，加入无菌水100μL，Ethachinmate 1μL，3mol/L的Sodium Acetate 10μL，乙醇250μL，振荡混合后进行离心。然后去除上清，加入150μL 70%的乙醇离心后，去除上清，干燥，再加入3μL的灭菌蒸馏水进行溶解。备用于杂交试验。

杂交操作中Tester：Driver=1:200的比率十分重要。乙醇沉淀导致部分DNA缺失是没有问题的。

Ｑ： 　DSN (Duplex-specific nuclease)有什么优点？

Ａ：　DSN是堪察加蟹肝脏来源的新型双链特异性DNA分解酶，可在双链DNA或DNA-RNA杂交过程中特异性切断DNA。最适宜温度55~65℃，Mg2+条件下，可用EDTA抑制其活性。因为DSN能在高温环境下进行反应，所以在DsDD法中，进行严格性较高的杂交反应。

Ｑ： 　一定要使用PCR管吗？

Ａ：　说明书记载DNA扩增反应应尽可能使用PCR管。热效率较好能进行正确的反应。

Ｑ： 　Drive ds cDNA的限定性酶处理是必要的么？

Ａ：　Tester和Driver的载体相同时，需要进行限定性酶处理。目的是防止因Primer结合引起非特异性杂交而导致DSN分解。用限定性酶只剪切Tester和Driver的cDNA，相辅的cDNA杂交。通过改变Tester和Driver端的Primer set，进而减少非特异性杂交。

Ｑ： 　扩增的Tester和Driver侧的Primer set可以是相同的吗？

Ａ：　同一Set也可以，但不是酶处理本身100%的反应。未处理的Driver cDNA Primer和Tester sscDNA的Primer结合，会通过DSN被分解。为了防止上述情况，建议扩增Tester和Driver端的PrimerSet还是要区分开。

Ｑ： 　限定性酶处理时如果出现Driver cDNA的内部被切断的话，会有影响吗？

Ａ：　没有影响。即使被切断了，还是能与Tester sscDNA进行杂交。

Ｑ： 　一定要进行Exonuclease I处理吗？

Ａ：　不是必要的操作。对Subtraction cDNA使用标记探针时，Exonuclease I能分解Driver的cDNA，可降低背景。

Ｑ： 　最后，扩增削减cDNA用到的Primer需要进行磷酸化吗？

Ａ：　不用，而是需要合成新的Primer。可以的话，建议使用最初的Primer内侧区域的Primer进行PCR操作。

Q: 配制Tester cDNA和Driver cDNA时使用的plasmid DNA会有影响吗？

Ａ：　没有影响的。DsDD法用的是双链特异性DNA分解酶（DSN），可分解plasmid DNA，所以不会影响。像生物素结合法、乳胶微粒oligo(dT)固相法这些传统方法，无法去除plasmid DNA，才会对转换和探针的制备等产生影响。

Ｑ： 　说明书推荐的TOPOTAQ DNA polymerase有什么特点？

Ａ：　本产品是Pyrococcus DNA polymerase和Taq DNA polymerase来源的催化结构域和甲烷细菌Methanopyruskandleri来源的非特异性DNA结合域融合的新型耐热性DNA Polymarase。本酶家族带有拓朴异构酶活性。通过这个特性，仅通过酶反应就能扩增GC-rich领域。这是目前其他酶都无法轻易做到的。TOPOTAQ DNA polymerase有热启动功能，能抑制非特异性的扩增。

Ｑ： 　Ethachinmate是什么？

Ａ：　Ethachinmate由NipponGene生产的，在核酸（DNA或RNA）被乙醇或异丙醇沉淀时使用的高分子载体。使用本品，能从浓度低的核酸溶液中定量回收微量核酸。加入乙醇或异丙醇后，无需进行-20℃或-80℃冷却，可直接离心。回收的核酸用缓冲液溶解后，可直接作为各种酶的基质使用。

Ｑ： 　去除的Subtracted cDNA有多大？

Ａ：　和光确认的大小为500~1500bp。最初用的cDNA库和DNA扩增的的延伸时间会影响Subtracted cDNA的大小。

Ｑ： 　Subtraction的效率是多少？

Ａ：　Tester端用肝癌细胞HepG2来源的cDNA，Driver端用人正常肝脏组织由来cDNA的话，Real-time PCR过程中GAPDH会被抑制至1/1,000。

Ｑ： 　对削减的基因进行亚克隆化，什么方法比较好？

Ａ：　一般采用的方法是：TA克隆或限定性酶处理后，插入目的载体，进行转换。

Ｑ： 　证明cDNA削减的方法是什么？

Ａ：　配制的Subtracted cDNA经过TA克隆后，在菌落PCR确认插入断片，接合探针，通过其在市面售卖的mRNA点膜上的斑点，判断是否有组织特异性基因存在的。还可以在数据库搜索序列，或解析DNA芯片的方法。