组织透明化试剂

SCALEVIEW^®-S

　　ScaleS技术由一组主要成分为尿素和山梨糖醇的组织透明化试剂组成。

　　开发此技术的理化研究所·脑神经科学研究中心和光量子工学研究中心通过进一步改良，研发出兼备出色透明度和可保留细微结构及荧光信号的新成果。

　　FUJIFILM Wako取得理化研究所的许可，把此项成果商品化，推出SCALEVIEW^®-S产品。

　　SCALEVIEW^®-S 不仅可以透明化含有荧光蛋白的生物标本，而且也可以有效应用于抗体或荧光染料标记的厚标本。它将有望成为分析脑组织病理标本的有力工具。

　　SCALEVIEW^®-S Trial Kit主要由从SCALEVIEW^®-S0到SCALEVIEW^®-SMt等6种试剂组成，可通过使用各试剂进行透明化的试剂盒。

数据提供：

国立研究开发法人理化学研究所

脑神经科学研究中心细胞机能探索研究组/光量子工学研究中心生命光学技术研究组

濱裕先生、星田哲志先生、宮脇敦史先生

合作：olympus株式会社

◆SCALEVIEW^®-S 组织透明化实验报告例子

■　小鼠大脑半球1-2mm厚切片

（※试剂用量标准：透明化处理和固定各5mL。）

※在组织透明化实验中，请注意试剂的使用量、处理的时间根据样本大小会有所改变。

此外，请尽可能在灌注固定后取出并重新固定样本。

 

■　使用SCALEVIEW^®-S小鼠大脑透明化例子

从左依次是小鼠大脑切片（1mm厚）SCALEVIEW^®-S处理前后和小鼠大脑半球SCALEVIEW^®-S处理前后

 

■　用双光子激发显微镜观察YFP-H line系小鼠透明化全脑——逐步放大基底神经节区域

点击查看protocol

◆免疫组织染色：AbScale 实验报告

■　小鼠大脑半球1-2mm厚切片

（※试剂用量标准为前处理各试剂：10mL、抗体染色：1.5mL、透明化：10mL、固定：10mL。）

* AbScale Solution : 含0.33 M 尿素、0.1 % (wt/vol) Triton X-100的PBS(-)溶液

 

■　阿尔茨海默病模型小鼠（17个月）大脑切片（2mm厚）通过AbScale法进行免疫组织染色的图

　  像例

◆荧光染料染色：ChemScale 实验报告

■　小鼠大脑半球1-2mm厚切片

（试剂用量标准为前处理各试剂：10mL、荧光染料染色：8mL、洗涤：10mL、透明化：10mL）

■　用共聚焦激光扫描显微镜（倒立）观察ChemScale处理（PI染色）后的YFP-H line小鼠大脑半球

     切片（2mm厚）

◆SCALEVIEW^®-S Neurosphere观察示例

■　Neurosphere

（试剂用量标准：前处理及透明化各试剂1.2mL。※抗体染色基于AbScale实验报告）

■　从成年大鼠海马体制备的神经干细胞Neurosphere三维免疫染色——使用AbScale法

组织透明化配套耗材：成像用透明室

透明化试剂方法选择流程.pdf	AbScale发进行直接IHC实验步骤.pdf

组织透明化试剂Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0

Q：组织透明化的原则

Ａ：组织透明化通常是按下面的步骤进行的：

Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脱色 （d）折射率匹配

 

Q：组织透明化的优势

Ａ：目前大多数可用的透明化技术，都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记，从而可视化

Ａ：组织中特定的蛋白。组织透明化成为了具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。

 

Q：透明化技术的比较

Ａ：下面是水性的透明化技术。

Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂，所以对于透明化DiI(细胞膜

Ａ：红色荧光探针，一种神经示踪剂)标记的样品和使用光电关联显微镜（CLEM）的情况下，SeeDB有着一定优

Ａ：势。另外SeeDB会产生自体荧光，有时候会对辨认未标记的神经元结构（如神经毡）起着一定帮助。

Ａ：SeeDB2是为使用高NA物镜的高分辨率成像而优化的技术；因此，当处理较大的组织时，CLARITY或者CUBIC

Ａ：会是更好的选择。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您应该根据您的物镜的WD（工作距离）来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过3mm。对于十分薄

Ａ：且脆弱的样品，我们建议使用琼脂糖包埋。

Ａ：使用CUBIC，可以让全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重复性。

 

Q：试剂盒成分

Ａ：具体如下：

Ａ：1. SCALEVIEW-S试剂盒（299-79001）适用于20份1-2mm的切片样品

Ａ：Ａ：1）　SCALEVIEW-S0——100mL

Ａ：Ａ：2）　SCALEVIEW-S1——100mL

Ａ：Ａ：3）　SCALEVIEW-S2——100mL

Ａ：Ａ：4）　SCALEVIEW-S3——100mL

Ａ：Ａ：5）　SCALEVIEW-S4——100mL

Ａ：Ａ：6）　SCALEVIEW-SMT——100mL

 

Ａ：2. SCALEVIEW-S试剂盒（290-80801）适用于20-30份1-2mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　SCaleCUBIC-1 Solution——250mL

Ａ：Ａ：2）　SCaleCUBIC-2 Solution——250mL

Ａ：Ａ：3）　Mounting Solution 1——40mL

Ａ：Ａ：4）　Mounting Solution 2——40mL

 

Ａ：3. SeeDB试剂盒（299-79901）适用于20-30份1-2mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：2）　SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：5）　SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：6）　SeeDB——50mL

 

Ａ：4. SeeDB2试剂盒（294-80701）适用于20-30份1-2mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　Saponin（皂角苷）——5g

Ａ：Ａ：2）　SeeDB2G solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB2S solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　PBS——50mL

 

Q：样品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的样品中的

Ａ：荧光信号。

Ａ：CUBIC处理的样品应在室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。

Ａ：SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年，而SeeDB2S处理的样品则可在室温下保存1年。您可以在1年内观

Ａ：察SeeDB透明化的样品中的荧光信号。

 

Q：抗体的荧光标记

Ａ：应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。

 

Q：适用于SCALEVIEW-S的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：适用于CUBIC的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：适用于SeeDB2的显微镜

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸镜头）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用复合浸没镜头）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸镜头）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制镜面的设备）

 

Q：重构

Ａ：对于定量用途，我们建议使用Neurolucida系统（MBF）。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时的表

Ａ：现。重构时也可以使用开源软件。例如，Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。

 

Q：物镜推荐

 

Q：其他物种？其他器官？

Ａ：对于昆虫样品和鱼类样品，建议选择CUBIC。

Ａ：昆虫相关文献：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：鱼类相关文献：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

　　对于多细胞球状体，选择SCALEVIEW-S会更好。

　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0

 

参考文献

[1]	Hama,H.et al.:ProtocolExchange（2016).doi:10.1038 /protex.2016.019.
[2]	Hama,H.et al.:Nat.Neurosci.,18,1518(2015).
[3]	濱裕、日置寛之、並木香奈、星田哲志、黒川裕、宮脇敦史：生体の科学，68（1），85（2017）.
[4]	日置寛之、濱裕、孫在隣、黄晶媛、並木香奈、星田哲志、黒川裕、宮脇敦史：日本薬理学雑誌， 149 （4），173（2017）.